서 론
재료 및 방법
실험동물의 사육
시료의 제조
시험물질
투여방법
수동회피 시험(Passive avoidance task)
Y-maze 시험(Y-maze task)
통계처리
결 과
새싹산양삼이 수동회피시험에서 학습과 기억력에 미치는 영향
경옥고 가미방이 수동회피시험에서 학습과 기억력에 미치는 영향
경옥고 가미방이 Y-미로 시험에서 단기 공간인지 기억력에 미치는 영향
경옥고 가미방과 경옥고의 단일 농도에서 Y-미로 시험에서 단기 공간인지 기억력에 미치는 영향
고 찰
서 론
최근 과학의 발달로 인해 기대 수명이 증가하고 있고, 이에 따라 퇴행성 질환인 치매에 대한 관심이 증가하고 있다. 치매는 퇴행성 질환으로서 현재 세계적으로 약 4,700만 명의 사람들이 이미 치매에 걸렸으며, 그 중 약 3,400만 명이 알츠하이머 치매(Alzheimer’s disease, AD)를 갖고 있다(Burns et al., 2009; Lee, 2011; Reynolds, 2019). 알츠하이머 치매는 기억력 및 판단력의 감퇴와 같은 뇌기능 저하와 언어 능력 저하 등의 임상적인 특징을 보인다(Crapper et al., 1978; Brookmeyer et al., 1998). 알츠하이머 병의 발병 기전은 복잡하고 한 가지의 특정적인 원인이 밝혀지지 않고 있으며 연구가 계속되고 있다. 현재 알츠하이머 치매의 치료제는 콜린성 가설(cholinergic hypothesis)을 바탕으로, acetylcholinesterase (AChE)를 억제하여 기억과 학습에 중요한 신경전달물질인 acetylcholine의 농도를 상승시키는 acetylcholinesterase inhibitor 계열의 약물로 donepezil, rivastigmine, galantamine 등이 있다(Polinsky, 1998; Weon et al., 2014). 하지만 현재 사용되고 있는 치료제는 일시적인 증상 완화와 병의 진행을 지연 시키는 효과만 있을 뿐 근본적인 알츠하이머 치매의 치료제는 아니며, 간과 관련된 부작용 및 구토, 설사와 같은 위장 장애를 일으키기 때문에 새로운 치료제의 개발이 필요하다(Dawson et al., 1993).
인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 대표적인 약용식물로 오가피과(Araliaceae)에 속하는 여러해살이풀로 한방에서는 주로 뿌리를 약용한다. 인삼의 효능으로는 암세포 증식 억제, 고콜레스테롤 저하작용, 혈소판 응집 억제 작용, 항산화 활성 및 피부암 진전 억제 작용이 있다고 알려진 바 있다(Joo, 2010). 전 세계적으로 새싹채소 활용 기능성식품 개발 기술은 전 세계적으로 도입단계이며, 브로콜리 새싹에서 항암 신물질 sulforaphane이 발견됨이 보고된 이후 연구가 가속화되고 있다(Subedi et al., 2019). 따라서 본 연구에서 스마트팜을 재배 새싹산양삼을 이용하여 실험을 진행하였다.
현재 경옥고의 약리활성에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(Kim, 2011). 경옥고는 동의보감과 방약합편에서 전통 한약 처방으로 복령, 인삼, 지황, 꿀로 구성되어 있고, 노령인구에 대한 보약 및 강장제로 사용되어 왔다. 경옥고는 정을 채워주고 골수를 보충해주는 효과가 있고, 건강향상 효과와 뇌수부족으로 오는 현훈, 건망증 치료, 위 점막 보호 작용, 폐결핵, 폐암, 골수억제 개선효과 등과 같은 질병 치료 보고가 있다. 경옥고가 스코폴라민(scopolamine) 유도 건망증 모델과 혈관성 치매 모델에서 기억력 개선 작용이 보고된 바 있으나, 그 효과를 가지는 투여용량이 높아 사람에게 그 효능의 발현을 기대하기 어려운 실정이다(Shin, 2011).
이에 본 연구진은 새싹산양삼을 포함하여 경옥고의 제조방법을 변형하여 새로운 약재를 추가하여 조성물을 제작하였으며, 본 연구에서 새싹산양삼과 경옥고 가미방의 기억력 개선 작용을 비교 확인하고자 하였다.
재료 및 방법
실험동물의 사육
5주령의 수컷 ICR 마우스를 주식회사 오리엔트에서 공급받아 사용하였다. 실험동물은 강원대학교 실험동물센터에서 일주일 간 적응시켰으며 적응기간 동안 동물실의 온도는 20－24°C, 습도 45－60% 내외, 조명은 12시간 주기로 일정하게 유지 하였다. 또한, 모든 기간 동안 동물은 사료와 물을 제한없이 공급받았다. 본 동물실험은 강원대학교의 동물실험윤리위원회의 승인(KW-171129-1)을 받은 후 규정에 따라 실행하였다.
시료의 제조
새싹산양삼의 경우, 스마트팜을 활용하여 재배 및 생산을 (주)달비치팜에서 수행하였다. 스마트팜의 온도는 24°C (day/16 hr)－19°C (night/8 hr)이며, 광원은 청색과 적색 LED (24 V)이고, 청색광 파장은 430－500 nm (peak 449.5 nm), 적색광 파장은 600－660 nm (peak 631.0 nm)으로 하였다. 새싹의 생장을 위해 물을 매 90분마다 30초간 분사하였다. 이 후 새싹산양삼을 분쇄한 후, 70% 에탄올을 새싹산양삼 무게의 10배 부피만큼 가한 뒤 60°C 물중탕으로 추출하였다. 이후 농축을 진행하고 동결건조하여 얻은 시료로 실험을 진행하였다.
경옥고 원방의 제조방법은 인삼, 복령, 지황 각 150 g 약재를 극세말하여 생지황즙과 꿀을 섞어 반죽한 후 중탕하여 만들었다. 경옥고 가미방의 제조방법은 경옥고 원재료인 인삼, 복령, 지황 각 150 g 비율로 극세말 한 것과 참당귀, 일당귀, 수국, 백년초, 천궁, 황금 각 300 g, 새싹산양삼 200 g 비율로 극세말하여 경옥고 가미방 재료로 사용하였다. 경옥고 원재료 극세말 1,200 g과 추가 약재 극세말 100 g 및 꿀 100 g을 넣어 경옥고 가미방 제조에 사용하였다. 각 분말에 달인 꿀과 물을 적절한 비율로 섞어 넣은 후, 2－3일간 열중탕하여 얻은 시료로 실험을 진행하였다(Kim, 2011).
시험물질
본 실험에서 사용한 스코폴라민은 Sigma Aldrich사(St. Louis, MO, USA.)의 최상급 제품을 사용하였고, 나머지 기타 시약은 시중에 있는 제품 중 최상급을 사용하였다.
투여방법
새싹산양삼(30, 100, 300 mg/kg), 경옥고 가미방(12.5, 100, 300, 1000 mg/kg), 경옥고(12.5, 1000 mg/kg)를 0.9% saline에 녹인 후 단회 경구 투여를 하였다. 정상군과 음성대조군에는 0.9% saline을 같은 용량으로 단회 경구 투여를 하였다. 복강 투여 30분 후에 행동 실험을 실시하였다. 스코폴라민으로 유도한 기억력 감퇴 모델을 이용, 실험을 진행 할 때에는 추가로 경구 투여 30분 후 0.9% saline에 용해한 스코폴라민 1 mg/kg의 용량으로 단회 복강 투여하였다.
수동회피 시험(Passive avoidance task)
수동회피 시험은 본능적으로 어두운 곳을 선호하는 마우스의 특성을 이용한 실험으로 학습 및 기억 능력 증진 효과를 평가하기 위한 일반적인 방법 중 하나이다(Shahidi et al., 2004). 크기는 40 cm × 20 cm × 20 cm로 아크릴 판을 중심으로 같은 크기의 두 방으로 나뉘어져 있고, 두 방을 나누는 벽에는 가로, 세로 각 20 cm인 문이 있어 상하로 열고 닫을 있게 되어있다. 좌측 방은 흰색 아크릴로 제작하였고 덮개에는 전구를 달아 밝은 환경을 조성할 수 있게 하였다. 우측 방은 검은색 아크릴로 제작하였으며 바닥에는 전기충격을 실험동물에 가할 수 있도록 어두운 방 밑면에 통전장치를 설치하여 0.5 mA의 전기충격을 3초 간 가할 수 있는 조건을 만들었다. 두 방 모두 실험동물을 살피기 위해 전면은 투명한 아크릴로 제작하였다.
마우스를 조명이 있는 밝은 방에 놓고 방을 10초간 탐색시킨 후 문을 열어 어두운 방으로 들어가게 하였다. 문이 열린 후 마우스가 어두운 방으로 뒷발까지 들어갈 때 시간을 측정하여 이 시간을 학습 시험(acquisition trial)이라고 명명하였다. 문이 열린 후 120초 이내에 어두운 방으로 들어가지 않는 동물은 실험에서 제외시켰다. 마우스가 어두운 방으로 들어가면 문을 닫고 전기 자극을 0.5 mA, 3초 동안 바닥을 통해 흐르게 하였으며 마우스가 이 상황을 기억하도록 하였다. 학습 시험(acquisition trial)을 실시한지 24시간이 지난 후에 장기 기억에 미치는 효과를 확인하고자 수동회피 획득 시험(retention trial)을 시행하였다. 10초의 탐색시간을 주고 문이 열린 후 어두운 방으로 들어가는데 걸리는 시간을 300초까지 측정하였다.
Y-maze 시험(Y-maze task)
Y-미로 시험은 실험동물의 단기 기억능력 및 공간지각능력의 회복을 평가하기 위한 시험이다. Y-미로 시험 장치는 검은 아크릴로 제작된 3개의 가지로 나뉘어있고, 각 가지의 길이는 35 cm, 넓이 3 cm, 높이 15 cm이고 각 미로는 서로 120°의 일정한 각도로 배치되어있다. 각의 미로를 A, B, C로 정한 뒤 하나의 가지에 실험동물을 놓고 8분간 자유롭게 움직이도록 한 후, 천장에 설치한 카메라를 통해 녹화하여 기록하였다. 각 가지에 들어간 순서를 기록하여 변경행동력(spontaneous alteration, %)을 평가하였다. 각각 다른 가지에 순차적으로 들어간 경우를 계산하여 1점(실제변경: actual alteration, ABC, ACB, BCA, BAC 등의 순서)으로 인정하였다. 각각 다른 가지에 연속되게 들어가지 않았을 때는 점수로 인정하지 않았다. 변경행동력(spontaneous alteration, %)은 다음 식 (1)으로 계산하였다(Sarter et al., 1988)
통계처리
통계처리는 GraphPad Prism 8.0 프로그램을 이용하여 처리를 하였으며, 실험값들은 mean ± S.E.M. 값으로 표기하였다. 실험군 비교는 one way analysis of variance (ANOVA)를 이용하여 검정하였다. 재검정은 유의성이 있는 경우에 Student-Newman-Keuls test를 이용하였다. 유의성은 P < 0.05 수준에서 판단하여 검정하였다.
결 과
새싹산양삼이 수동회피시험에서 학습과 기억력에 미치는 영향
ICR 마우스에게 새싹산양삼(30, 100, 300 mg/kg)를 경구 투여하고 30분 후 스코폴라민(1 mg/kg)로 복강 투여한 후 30분 뒤 행동실험을 진행하였다. 어두운 방까지 이행하는데 걸린 시간(머무름 시간)을 측정하고 전기충격을 가해 학습 시험(acquisition trial)을 실시하였다. 학습 시험이 끝나고 24시간이 지난 뒤 획득 시험(retention trial)을 실시하였다. 획득 시험은 투여 없이 마우스가 문이 열린 뒤 어두운 방까지 이행하는데 걸린 시간을 측정하였다. 어두운 방으로 가는데 걸리는 시간이 오래 걸릴수록 수동회피의 학습과 기억이 좋다는 것을 판단할 수 있다.
새싹산양삼의 경우, 학습시험에서 유의적인 차이를 보이지 않았으므로 투여에 의한 운동성 변화를 보이지 않았고(Fig. 1A), 24시간 후 같은 공간에서 머무름 시간을 측정한 결과(retention trial), 스코폴라민을 처리한 음성대조군(72.5 ± 27.0초)은 정상군(255.6 ± 25.6초)의 머무름 시간에 비해 유의적으로 감소하였으며, 이를 통해 스코폴라민에 의해 기억력 손상이 유발되었다고 판단하였다. 새싹산양삼 30 mg/kg에서 머무름 시간이 300.0초 수준으로 회복하는 것을 확인하였다(Fig. 1B).
Fig. 1.
Ameliorating effect of ginseng sprout extract on scopolamine-induced cognitive impairment in mice measured by passive avoidance task. Mice were pretreated with ginseng sprout extract (30, 100, and 300 mg/kg) for 30 min before the administration of scopolamine (1 mg/kg). After 30 mins, acquisition trial (A) and retention trial (B) were performed after 24 h. Data are represented as mean ± S.E.M. and analyzed by One-way ANOVA followed by Student-Newman-Keuls test (*P < 0.05; ***P < 0.001 versus scopolamine-only treatment, ###P < 0.001 versus Normal only).
경옥고 가미방이 수동회피시험에서 학습과 기억력에 미치는 영향
ICR 마우스에게 경옥고 가미방(100, 300, 1000 mg/kg), 경옥고(1000 mg/kg)를 경구 투여하고 30분 후 스코폴라민(1 mg/kg)로 복강 투여한 후 30분 뒤 행동실험을 진행하였다. 실험은 이전 수동회피시험과 동일하게 진행하였다.
경옥고 가미방의 경우, 학습시험에서 유의적인 차이를 보이지 않았으므로 투여에 의한 운동성 변화를 보이지 않았고(Fig. 2A), 24시간 후 같은 공간에서 머무름 시간을 측정한 결과(retention trial), 스코폴라민을 처리한 실험군(48.8 ± 5.4초)은 정상군(295.1 ± 3.4초)의 머무름 시간에 비해 유의적으로 감소하였으며, 이를 통해 스코폴라민에 의해 기억력 손상이 유발되었다고 판단하였다. 또한 경옥고 가미방의 100, 300, 1000 mg/kg의 단회 경구 투여에 의하여 농도 의존적으로 머무름 시간이 증가하였고, 경옥고 가미방 투여군의 1000 mg/kg의 농도에서 196.5 ± 18.6초 수준으로 이는 경옥고 1000 mg/kg의 농도 값인 197.3 ± 11.3초와 비슷한 수준으로 회복한 것을 확인 하였다(Fig. 2B).
Fig. 2.
Ameliorating effect of ginseng sprout extract on scopolamine-induced memory impairment in mice measured by passive avoidance task and Y-maze task. Mice were pretreated with modifiec Kyung-Ok-Ko (Modified KOK, 100, 500, and 1000 mg/kg) or Kyung-Ok-Ko (KOK, 1000 mg/kg) 30 min before the administration of scopolamine (1 mg/kg). In the passive avoidance task, an acquisition trial was performed after 30 min (A). A retention trial (B) was performed after 24 h. Spontaneous alternation behavior was recorded in the Y-maze task (C) during an 8 min session. Data are represented as mean ± S.E.M. and analyzed by One-way ANOVA followed by Student-Newman-Keuls test (**P < 0.01; ***P < 0.001 versus the scopolamine-only treatment, ###P < 0.01 versus Normal only).
경옥고 가미방이 Y-미로 시험에서 단기 공간인지 기억력에 미치는 영향
ICR 마우스에게 경옥고 가미방(100, 300, 1000 mg/kg), 경옥고(1000 mg/kg)를 경구 투여하고 30분 후 스코폴라민(1 mg/kg)을 복강 투여한 후 30분 뒤 Y-미로 시험을 실시하였다.
정상군의 경우 변경행동력(spontaneous alternation)이 77.9 ± 4.4%로 나타났으나, 스코폴라민 투여군의 경우 변경행동력이 44.5 ± 4.2%으로 정상군 대비 유의성 있게 감소하는 경향을 나타내었다. 경옥고 가미방은 100, 300, 1000 mg/kg의 단회 경구 투여에 의하여 변경행동력이 농도 의존적으로 유의성 있게 증가하는 경향을 보였다(Fig. 2C). 이는 경옥고 가미방의 투여가 단기 공간인지 기억력을 회복시킨다고 볼 수 있다.
경옥고 가미방과 경옥고의 단일 농도에서 Y-미로 시험에서 단기 공간인지 기억력에 미치는 영향
경옥고 가미방과 경옥고는 단기 공간인지 기억력을 회복시키는 것을 확인하였다. 이보다 더 낮은 농도에서 효과가 있다면 임상적으로 큰 의미가 있기에 두 제품을 낮은 단일 농도 비교 시험을 진행하였다.
경옥고 가미방과 경옥고의 단일 농도(12.5 mg/kg) 비교 시험에서는 정상군의 경우 변경행동력(spontaneous alternation)이 76.7 ± 4.8%로 나타났으나, 스코폴라민 투여군의 경우 변경행동력이 42.0 ± 4.1%으로 정상군 대비 유의성 있게 감소하는 경향을 나타내었다. 경옥고 가미방과 경옥고 12.5 mg/kg의 단회 경구 투여에 의하여 변경행동력이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 경옥고 가미방과 경옥고를 비교하였을 때, 경옥고 가미방이 경옥고보다 유의적으로 더 증가한 것을 확인하였다(Fig. 3). 이는 단일 농도에서 경옥고보다 경옥고 가미방이 단기 공간인지 기억력을 비교적 많이 회복시킨다고 판단할 수 있다.
Fig. 3.
Ameliorating effect of Modified Kyung-Ok-Ko (Modified KOK) on the cognitive impairment caused by scopolamine in ICR mice measured by Y-maze task. Spontaneous alternation behavior and the number of arm entries were recorded during an 8 min Y-maze task session. Data are represented as mean ± S.E.M. and analyzed by One-way ANOVA followed by Student-Newman-Keuls test (***P < 0.001 versus the scopolamine-only treatment, ###P < 0.001 versus Normal only, $$$P < 0.001 versus Kyung-Ok-Ko only).
고 찰
새싹산양삼의 인지 기억력 향상을 관찰하기 위하여 스코폴라민을 투여한 기억 손상 마우스 모델을 이용하여 수동회피 시험을 실시하였다. 결과에서, 통계적으로 유의성 있는 인지 및 기억력 향상 효과를 관찰하였다. 수동회피 시험에서 나타난 머무름 시간은 학습 기억력 회복의 지표로 사용된다. 수동회피 시험에서 새싹산양삼 추출물 30 mg/kg의 경우 스코폴라민을 투여한 실험군의 감소한 머무름 시간을 유의적으로 증가시켰다. 하지만 그보다 더 높은 용량에서는 30 mg/kg 보다 효과를 보이지 않았다. 이는 inverted U-shaped curve dose-effect curve 관계에 접목해 볼 수 있다. 이는 약리학적으로 치료의 긍정적 행동을 연구할 때 보고되는 비선형 관계로써, 주어진 화합물 또는 천연물의 용량을 증가시키는 효과는 최대까지 증가한 것으로 나타나고 그 후 효과는 감소하는 관계 그래프이다(Elisabetta et al., 2005). 따라서 새싹산양삼 추출물은 30 mg/kg에서 가장 높은 효과를 보이게 되고, 300, 1000 mg/kg에서는 적은 효과를 보인 것으료 사료된다.
경옥고 가미방의 효과를 보기 위해서 인지 및 공간기억력 향상 효과를 관찰하기 위해서 스코폴라민으로 유도한 기억 손상 마우스 모델을 이용하여 수동회피시험과 Y-미로시험을 실시하였다. 수동회피시험에서 경옥고 가미방을 투여한 실험의 경우 스코폴라민 단독 투여군에 비해 머무름 시간의 유의한 향상을 보였으며, 경옥고 가미방의 농도가 높아질수록 머무름 시간이 향상하는 것을 확인하였다. 경옥고 가미방 1000 mg/kg 농도는 경옥고 1000 mg/kg 투여한 그룹과 동일한 수준 까지 올라간 것을 확인하였다. Y-미로 시험에서 보인 변경행동력(spontaneous alteration, %)은 공간인지 단기 기억력 회복의 지표로 사용된다. 실험결과에서 경옥고 가미방을 투여한 실험군의 경우 스코폴라민 단독 투여군에 비해 변경행동력의 유의한 향상을 보였으며, 투여한 경옥고 가미방의 변경행동력이 농도의존적으로 기억력이 회복되는 것을 확인하였다. 또한, 수동회피실험 결과와 동일하게 경옥고 가미방 1000 mg/kg 농도는 경옥고 1000 mg/kg 투여한 그룹과 동일한 수준 까지 올라간 것을 확인하였다.
동일 농도(12.5 mg/kg) 비교 시험에서는 경옥고와 경옥고 가미방 둘 다 유의적으로 증가 하는 것을 확인하였고, 경옥고보다 경옥고 가미방이 더 동일 농도에서 회복효과가 뛰어난 것을 확인하였다. 이러한 이유를 보이는 것은 첨가물들의 시너지 효과가 일어난 것으로 판단된다. 천연물을 여러 가지 넣을 경우 각각의 천연물 효과뿐만 아니라 시너지 효과가 발현할 수 있다는 연구가 보고된 바 있다(Lindsay et al., 2019). 경옥고가 스코폴라민 투여 동물 모델에서의 효과가 이미 보고된 바가 있지만, 투여용량이 높아 사용의 기대치가 낮은 것이 문제였다. 하지만 본 연구에 사용된 경옥고 가미방의 경우 경옥고에 비해 더 뛰어난 효과를 나타내었으므로 경옥고에 비해 더 적은 투여 용량으로 효과를 볼 수 있을 것으로 사료된다.
이러한 점을 미루어 봤을 때, 새싹산양삼 및 경옥고 가미방이 기억력 손상 상태에서 학습능력과 기억력을 향상시키고 콜린성 기능 장애로 인한 기억 상실 상태를 약화 시킬 수 있다고 사료된다. 따라서 앞으로 새싹산양삼 및 경옥고 가미방의 기억력 회복효과에 대한 세부 기전 연구가 필요하다.
