Journal of Agricultural, Life and Environmental Sciences. July 2019. 64-71
https://doi.org/10.22698/jales.20190008


ABSTRACT


MAIN

  • 서 론

  • 재료 및 방법

  •   아스파라거스 주요 병원균 및 식물추출물 선정

  •   디스크 확산법에 따른 식물추출물 선발

  •   식물추출물의 병원균 균사 생장억제효과 검정

  •   식물추출물의 병원균 포자생성 억제효과 검정

  • 결 과

  •   디스크 확산법에 따른 유기농자재 선발

  •   유기농자재의 병원균 균사 생장억제효과

  •   유기농자재의 병원균 포자 생성억제효과

  • 고 찰

  • 요약 또는 결론

서 론

아스파라거스(Asparagus officinalis L.)는 백합과의 여러해살이 온대성 채소로 전 세계에 약 300종이 알려져 있으나 일부만 식용으로 이용하고 나머지는 주로 관상용이나 재배종 품종 육성에 이용되고 있다. 아스파라거스에는 비타민, 아미노산과 단백질이 풍부하고 특히 다량의 아스파라긴산이 함유되어 피로회복 및 숙취 해소에 탁월하다. 그리고 플라보노이드 계열의 폴리페놀 성분과 스테로이드 사포닌 계열의 식물성 스테롤 등 기능성 성분들은 각종 항암, 항산화에 탁월한 효과가 있다고 알려져 있다(Lee et al., 2015). 아스파라거스의 재배는 파종 후 3년까지 뿌리 양성 기간이 필요한데 수확 기간은 15년 정도로 긴 기간에 수확이 가능한 장점이 있다. 장기간 지속적인 관리를 위해서는 식물병으로부터의 관리가 중요하다. 국내 아스파라거스에 발생하는 주요 병해인 Poitrasia circinans에 의한 꽃썩음병(fruit and blossom rot), Botrytis cinerea에 의한 잿빛곰팡이병(gray mold), Fusarium oxysporum에 의한 줄기썩음병(crown and root rot), Stemphylium vesicarium에 의한 자색반점병(purple spot) 등이 있다. 2019년 최근 들어 아스파라거스 병해충 관리를 위한 농약이 등록되기 시작했으나, 아직 등록되지 않은 병해도 있어 재배 농가에서는 이러한 식물병 방제를 위하여 등록되지 않은 살균제를 무분별하게 사용하고 있다.

국내 농업여건의 변화는 식품에 대한 소비자의 관심과 흐름에 따라 80년대 이전에는 다수확, 90년대에는 고품질, 그리고 이후에는 식품의 안전과 건강을 위한 친환경을 위한 농업으로 변화하였다. 친환경농산물은 농약과 화학비료를 최대한 사용하지 않고 재배한 농산물을 일컫는데, 무농약농산물과 유기농산물 두 가지로 구분된다. 무농약농산물은 농약을 전혀 사용하지 않고 화학비료를 권장량의 3분의 1 이하로 사용한 것이며, 유기농산물은 화학비료와 농약을 전혀 사용하지 않고 재배하는 것을 말한다. 2000년부터 현재까지 무농약과 유기농 인증면적은 각각 연평균 약 28% 이상 증가하였다. 2017년 기준 국내 친환경농산물 시장규모는 1조 3,608억 원으로 향후 연평균 5.8% 성장하여 2025년에는 2조 1,360억 원에 이를 것으로 전망하고 있다(Jung et al., 2018). 친환경농업의 발전과 더불어 유기농자재 시장도 확대되고 있으며, 현재 2019년 3월 국립농산물품질관리원의 유기농업자재정보시스템에 1,654개 유기농자재가 등록되어 있다. 유기농자재의 종류에 따라서 토양개량 및 작물생육용, 병해 및 충해관리용으로 구분하고 있으며, 유기농자재의 원료 종류에는 광물질, 미생물, 식물추출물 등이 사용되고 있다.

전 세계적으로 아스파라거스의 소비는 증가하고 있으며, 국내산 아스파라거스는 우수한 품질을 인정받아 일본 수출이 증대되고 있을 뿐만 아니라 소비가 많은 대만, 호주 등에 시험수출을 하고 있다. 그러나 합성농약의 장기간 무분별한 사용으로 인한 생태계 파괴뿐만 아니라 농약잔류 문제로 수출대상국에 따른 검역과정에서 큰 영향을 미치고 있다. 식물추출물은 과거부터 향신료 및 식용식물 그리고 한약재 등에서 항균성을 갖는 것이 알려져 왔으며, 현대에 이르러 천연자원에 대한 개발로 식물에서 추출한 타감화합물(allelochemical)에 의한 항균작용이 보고되고 있다(Park et al., 2005). 유기농자재로 등록된 식물추출물의 종류에는 차나무, 대황, 목초액, 자몽종자, 황련, 정향나무, 계피오일, 목초액, 미파자오일 등이 있으나, 이들의 보고된 항균작용은 주로 세균성 병원균(Lee et al., 2004; Lim and Kim, 2003)이나 동물 병원성 곰팡이(Kong et al., 2001; Park and Kim, 2006)에 국한되어 있다. 따라서 본 연구는 국내 등록된 식물추출물 유기농자재를 선발하여 아스파라거스 주요 병원성 진균들에 대한 항진균 활성을 검증하여 아스파라거스 재배에서 합성농약을 대체할 수 있는 유기농자재를 선발하고자 하였다.

재료 및 방법

아스파라거스 주요 병원균 및 식물추출물 선정

본 연구에 사용된 아스파라거스 주요 병원균은 2017-2018년도 강원도 춘천과 양구 아스파라거스 재배지역에서 직접 분리하여 18s rRNA 및 기타 염기서열 분석을 통해 동정된 균주를 사용하였다. 아스파라거스 주요 병원균 4종 중 F. oxysporumS. vesicariumShin et al. (2018)Han et al. (2019)에서 사용한 균주를 사용하였다. P. circinansB. cinerea는 같은 방법으로 분리하고 동정한 균주를 사용하였다. 식물추출물 유기농자재는 국립농산물품질관리원 유기농업자재정보시스템(http://organicpro.enviagro.go.kr)을 이용하여 국내 등록된 병해 및 병충해관리용 식물추출물을 자재로 이용한 제품을 분류하여 선정하였다.

디스크 확산법에 따른 식물추출물 선발

PDA (potato dextrose agar, difco) 배지에서 5일 간 키운 각 병원균의 균사 끝부분을 코르크보러를 이용하여 4 mm agar plug로 떼어내어 새 PDA배지 한 가운데 접종하였다. 이 후 25°C에 광조건 16시간, 암조건 8시간의 배양기에서 3일 동안 배양한 후 각 유기농자재를 일정한 간격으로 배치한 paper disk에 식물추출물 유기농자재 원액을 20 ul 씩 접종하여 5일 동안 추가 배양하여 paper disk와 균사 끝 부분까지의 길이를 측정하였다.

식물추출물의 병원균 균사 생장억제효과 검정

아스파라거스의 주요 병원균에 대한 효과가 우수한 식물추출물 유기농자재 원액을 PDA배지에 3가지 농도(500 ppm, 1,000 ppm, 2,000 ppm)로 식물추출물을 함유한 배지를 만들었다. 그리고 위와 같은 방법으로 배양한 병원균의 agar plug를 배지 한 가운데 올려놓고 8일 간 배양한 후에 균사생장 억제 정도를 아래와 같은 식 (1)로 측정하였다. 모든 실험은 3반복으로 수행하였다.

균사생장억제율(%) = (무처리구 - 처리구 / 무처리구 균사길이) × 100 (1)

식물추출물의 병원균 포자생성 억제효과 검정

아스파라거스 주요 병원균의 포자생성 억제효과를 검정하기 위하여 위와 같은 방법으로 만든 배지를 6-well plate에 분주하였다. 배양한 병원균 agar plug를 배지 가운데 접종하고 각 병원균별로 6-well plate에 끝까지 다 자라서 포자를 생성하는 접종 후 6일 차에 멸균수 5 mL을 넣고 e-tube 끝으로 긁어내어, 포자 현탁액에서 혈구계산판(hemocytometer)을 사용하여 포자수를 측정하였다. 모든 실험은 3반복으로 수행하였다.

결 과

디스크 확산법에 따른 유기농자재 선발

디스크 확산법은 세균의 항생제 감수성을 측정하는 방법으로 항생제가 포함된 디스크를 배지에 올려두면 디스크 주위로 항생제 성분이 확산한다. 병원균이 항생제 감수성을 가질 경우, 항생제 성분이 특정 농도 이상인 부분에서 생장이 억제되어 고리 모양의 억제 영역을 관찰할 수 있다. 이를 본 연구에 적용하여 아스파라거스 병원성 진균이 접종된 배지에 식물추출물 유기농자재를 함유한 디스크를 놓고 1차 스크리닝을 수행하였다(Fig. 1). 그 결과 4종의 병원균에서 모두 균사생장 저지효과를 나타낸 것은 정향나무, 황련 + 대황, 자몽 + 다래 + 드린국화 추출물에서 효과를 보였다. 그리고 P. circinansF. oxysporum은 계피오일 + 차나무 추출물에서도 비교적 우수한 효과를 보였으며, S. vesicarium은 다른 병원균과 다르게 황련 추출물에서도 강한 저지효과를 나타내었다. 이러한 결과를 종합하여 우수한 효과를 나타낸 식물추출물을 선발하고 다음 연구를 수행하였다(Table 1).

http://static.apub.kr/journalsite/sites/ales/2019-031-02/N0250310204/images/ales_31_02_04_F1.jpg
Fig. 1.

Selection of plant extracts by disk diffusion against major asparagus diseases. C shows no treatment; see table 1 for respective values.

Table 1. Selection of plant extracts by the disk diffusion method for four asparagus pathogens

No. Contents (%) Poitrasia
circinans
Botrytis
cinerea
Fusarium
oxysporum
Stemphyillium
vesicarium
1 대황(Rhubarb) 92% + 피마자오일(Castor oil) 3% -1) - - -
2 차나무(Tea plant) 10% + 피마자오일(Castor oil) 22% - - - -
3 영릉향(LysimachiaeFoenum-GraeciHerba) 5% - - + +
4 계피오일(Cinnamon oil) 28% + 차나무(Tea plant) 25% +++ - +++ +
5 자몽종자(Grapefruit seed) 10% + 다래나무(Bower actinidia) 30% +
드린국화(Purple coneflower) 5%
+++ ++ +++ +++
6 차나무(Tea plant) 25% + 계피(Cinnamon) 5% ++ + - ++
7 정향나무(Clove tree) 70% +++ +++ ++++ ++++
8 소프넛(Soap nut) 40% + 계피오일(Cinnamon oil) 20% + + ++ ++
9 황련(Coptischinesis) 80% + + ++ +++
10 황련 + 대황(Coptischinesis, Rhubarb) 7% ++++ ++++ ++++ +++
1)Determined by measuring the average diameter of the clear zone of inhibition: +, < 5 mm; ++, 6-10 mm; +++, 11-15 mm; ++++, > 15 mm.
2)Selected plant extracts are marked in bold.

유기농자재의 병원균 균사 생장억제효과

각 병원균별로 선발된 식물추출물 유기농자재의 농도에 따른 균사 생장 억제효과를 알아보고자 농도별로 첨가된 배지에 병원균을 접종하고 균사 생장 억제율을 측정하였다(Fig. 2). 그 결과 P. circinans에서는 정향나무와 자몽 + 다래 + 드린국화 추출물은 낮은 농도의 500 ppm에서도 각각 79.4%와 78.2%로 우수한 균사 생장 억제율을 나타내었다. 그리고 두 식물추출물을 포함하여 계피오일 + 차나무와 황련 + 대황 추출물은 2,000 ppm에서 약 90% 이상의 균사 생장 억제율을 보이는 것으로 나타났다. B. cinerea는 가장 효과가 우수한 것은 정향나무 추출물로 500 ppm에서 86.2%의 우수한 억제효과를 나타내었다. 그리고 2,000 ppm에서는 황련 + 대황 추출물도 100%로 완전히 균사가 생장하지 않는 것이 관찰되었다. F. oxysporum에서도 정향나무 추출물이 500 ppm에서 59.7%로 가장 억제효과가 좋았으며, 2,000 ppm에서는 정향나무와 황련 + 대황 추출물이 각각 77.4%와 78.5%로 균사 생장 억제효과가 우수하였다. 마지막으로 S. vesicarium은 500 ppm에서 4종류 모두 80% 이상의 우수한 균사 생장 억제효과를 보였으며, 2,000 ppm에서는 약 90%의 균사 생장 억제효과를 나타내었다. 이 결과로 4종의 병원균에 따른 식물추출물 유기농자재의 감수성이 서로 다르다는 것을 알 수 있고, 전체적으로 정향나무 추출물이 낮은 농도에서도 가장 우수한 균사 생장 억제율을 보이는 것을 알 수 있었다.

http://static.apub.kr/journalsite/sites/ales/2019-031-02/N0250310204/images/ales_31_02_04_F2.jpg
Fig. 2.

Inhibition of mycelial growth of major pathogens of asparagus by plant extracts.

유기농자재의 병원균 포자 생성억제효과

대부분의 진균은 포자를 생산하여 바람이나 비에 의해 병을 퍼뜨리는 생활환을 가지고 있다. 따라서 선발된 식물추출물 유기농자재를 이용하여 병원성에 중요한 인자인 포자생성을 억제할 수 있는지 in vitro에서 포자생성을 유도하기 쉬운 P. circinansF. oxysporum 2종을 이용하였다(Fig. 3). 그 결과, P. circinans는 500 ppm의 자몽 + 다래 + 드린국화 추출물에서 89.0%의 우수한 포자 생성억제효과를 나타내었다. 2,000 ppm을 첨가한 배지에서는 계피오일 + 차나무, 정향나무, 자몽 + 다래 + 드린국화 추출물에서 각각 98.9%, 96.5%, 93.9%를 나타내어 포자생성을 대부분 억제하는 것으로 나타났다. F. oxysporum은 정향나무 추출물이 500 ppm에서도 94.3%의 포자생성 억제율을 나타내어 우수한 효과를 보였다. 그리고 2,000 ppm에서는 황련 + 대황, 정향나무, 자몽 + 다래 + 드린국화 추출물에서 각각 99.4%, 97.7%, 86.8%의 높은 포자생성 억제율을 보였다.

http://static.apub.kr/journalsite/sites/ales/2019-031-02/N0250310204/images/ales_31_02_04_F3.jpg
Fig. 3.

Inhibition of conidiation of two pathogens of asparagus by plant extracts.

고 찰

화학 비료나 농약의 사용에 크게 의존하는 농업은 생산량의 증가를 가져왔다. 하지만 이로 인한 농약 잔류, 토양의 황폐화, 생태계 파괴 등과 같은 문제를 야기하고 있다. 따라서 이를 대체할 수 있는 생태계에 해가 적고, 안정적으로 병해충을 방제할 수 있는 생물농약의 개발과 연구가 활발히 진행되고 있다(Kim, 2015). 생물농약은 동물이나 식물, 미생물, 광물질 등 천연물을 통해 얻어진 산물 또는 특정 물질로 700종류 이상의 사용 가능한 활성 성분이 있는 것으로 알려져 있다. 이에 따라 국내에서도 다양한 식물 소재를 활용하고 있으며, 주로 식물의 2차 대사산물로 페놀, 알카로이드, essential oils, terpenoids, phytoalexin 등이 있으며, 제충, 제초, 항균활성 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Cantrell et al., 2001; Cho and Shin, 2004; Moon et al., 2004; Van Peer et al., 1991).

아스파라거스는 강원도뿐만 아니라 충남, 전북, 제주도 등지에서 재배면적이 늘어나고 있으며, 우수한 국내 아스파라거스의 수출량도 증가하고 있는 추세이다. 본 연구에서는 국내 등록 시판중인 유기농자재 중 다양한 단일 및 혼합 식물추출물을 선정하여 아스파라거스 주요 병원균에 적용할 수 있는 유기농자재를 선발하고자 하였다. 10종류의 식물추출물 유기농자재의 디스크 확산법에 의한 아스파라거스 주요 병해 4종에 대한 스크리닝 결과 감수성 정도는 차이가 있었지만 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 공통적으로 정향나무, 황련 + 대황, 자몽 + 다래 + 드린국화 추출물에서 효과를 나타내었으며, 단일 추출물로 볼 때 황련 + 대황 추출물에 비교하여 대황 + 피마자오일은 효과가 없는 것으로 보아 황련추출물에 의한 효과이거나 두 추출물의 시너지효과에 의해 나타난 것으로 보여 진다. 또한, 본 연구에 사용된 계피 또는 차나무 성분이 들어가 있는 유기농자재는 여러 종류가 있었는데 병원균마다 감수성에 차이를 보였다. 이것은 혼합물의 성분 함량에 따른 차이도 있지만 추출물을 제조하는 방법에 따른 차이가 있을 것으로 예상된다. 추출물을 제조할 때 일반적으로 각각 극성이 다른 물, 메탄올, 알코올 또는 석유 에테르 등의 사용이 가능하며, 추출 조건에 따라 항균활성에 차이를 보이기 때문이다(Lee et al., 2004).

본 연구에서 가장 균사생장 및 포자 생성 억제에 가장 우수한 정향나무 추출물의 항균활성은 Escherichia coli, Staphylococcus aureus. Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa 등 세균에 항균효과를 나타낸다는 것이 보고되었다(Lee et al., 2004). 그리고 정향나무와 계피오일로 Penicillium italicum에 의한 귤 푸른곰팡이병의 균사 생장을 억제한다는 연구도 보고된 바 있다(Anjum and Akhtar, 2012). 또한 P. circinansS. vesicarium에 효과가 좋은 자몽 + 다래 + 드린국화 추출물에서 자몽 종자 추출물은 세균에 대한 항균활성 보고가 있으며, 그람 양성균에 대한 높은 저해 활성을 보였다(Park and Kim, 2006). 또한 사람 피부에 칸디다증을 일으키는 Candida 종에 대한 항진균 효과가 밝혀졌다(Eslami et al., 2017). P. circinansF.oxysporum에 균사 생장 및 포자 생성 억제 효과를 나타낸 차나무추출물은 식중독균과 효모 및 곰팡이 등에 항균활성을 가지며 항종양 활성 또한 갖는 것으로 보고되었다(Yoon et al., 2005). 드린국화 추출물은 효모 및 Candida 종에 대한 항진균 활성이 알려져 있으며, undeca-2E,4Z-diene-8,10-diynoic acid isobutylamide와 dodeca-2E,4E,8Z,10E/Z-tetraenoic acid isobutylamide의 활성물질에 의한 것으로 연구되었다(Binns et al., 2000). 공통적으로 효과가 우수하였던 황련은 전통적으로 진정, 소염, 항균 및 해열에 쓰이고 있으며, 주성분인 berberine은 강력한 항균작용을 가지는 것으로 알려져 있다(Kim et al., 2018). 대황 추출물은 phenol성 화합물인 2-methoxy-phenol, 4-vinyl-2-methoxy-phenol 등에 의한 식품위해성 미생물에 대하여 항균효과를 갖는 것이 연구되었다(Lim and Kim, 2003).

본 연구결과는 아스파라거스 주요 병해에 사용할 수 있는 식물추출물 유기농자재의 균사 생장 및 포자 생성을 in vitro시험을 통해 억제효과를 검정하였으며, 이는 합성농약을 대체할 수 있는 생물농약의 중요한 기초자료를 제공하며, 추가적으로 이 결과를 활용하기 위한 아스파라거스 포장시험 등의 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다.

요약 또는 결론

아스파라거스 주요 병해 4종(Poitrasia circinans, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Stemphyillium vesicarium)에 대해 효과가 우수한 식물추출물 유기농자재를 선발하기 위하여 시판중인 10종의 단일 및 혼합 식물추출물 유기농자재를 선정하였다. 디스크 확산법을 이용한 1차 스크리닝 결과 공통적으로 정향나무, 황련 + 대황, 자몽 + 다래 + 드린국화 추출물에서 효과를 나타내었다. 그리고 500, 1,000, 2,000 ppm의 농도에 따른 균사 생장 억제율을 측정한 결과, P. circinans에서는 정향나무와 자몽 + 다래 + 드린국화 추출물은 낮은 농도의 500 ppm에서도 각각 79.4%와 78.2%의 억제율을 나타내었다. B. cinereaF. oxysporum은 정향나무 추출물 500 ppm에서도 각각 86.2%와 59.7%로 가장 효과가 우수한 것으로 나타났다. S. vesicarium은 유기농자재 4종 모두 500 ppm에서 약 80%로 효과가 좋은 것으로 나타났다. 포자생성 억제효과는 병원균 2종을 이용하였는데, P. circinans는 500 ppm에서 자몽 + 다래 + 드린국화와 정향나무 추출물에서 89.0%의 우수한 포자 생성억제효과를 보였으며, F. oxysporum은 정향나무 추출물이 500 ppm에서도 94.3%의 포자생성 억제율을 나타내어 우수한 효과를 보였다. 본 연구결과는 국내 아스파라거스 주요 병해를 생물학적으로 방제하기 위한 기초자료로 사용할 수 있을 것이다.

Acknowledgements

본 연구는 농림축산식품부, 농림수산식품기술기획평가원의 연구개발사업(117035-03)과 2018년도 강원대학교 국립대학 육성사업비의 지원을 받아 수행된 것으로 이에 감사드립니다.

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